共聚焦显微镜下的真香世界 | 微观，妙不可言

小世界

尼康的微距摄影比赛——小世界摄影大赛（Nikon Small World Competition）最早开始于1975年，旨在表彰那些通过光学显微镜进行摄影的人的努力付出。从那时起，“小世界”每年都会吸引来自全世界的医生、科学家以及显微摄影爱好者前来参赛，这项比赛也就成了世界上显微摄影技术的主要展示平台。近日，这个比赛公布了2020年度的获奖作品。

今年的大奖授予了美国国立卫生研究院的一个团队，他们拍摄到了一张评委认为“技术上接近完美”的幼年斑马鱼的照片。这张照片使用共聚焦显微镜和图像堆叠技术创作完成。这些影像结合了研究、创造力、影像技术和专业知识，其中不少还是生物科学领域和显微摄影技术运用上的重要突破，值得好好欣赏！

丛枝菌根真菌的多核孢子和菌丝

你了解什么是共聚焦显微镜？

显微镜是人类最伟大的发明之一。从远古时代，人们就渴望看到更多肉眼看不到的事物。

随着科学技术的发展，科研已开始由宏观转向微观世界，与此同时，激光共聚焦显微镜也成为课题组内经常使用的仪器。

荧光显微镜为啥不香？

在生物学研究中，科学家们常常利用能发射荧光的荧光分子作为生物标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中‘揪出来’。荧光寿命可以反映细胞生命活动的环境参量，例如环境PH值、离子浓度、含氧量等，同时也是区分荧光蛋白分子、反映荧光蛋白分子动力学特征的重要参数，在细胞生物学等领域中具有广泛应用。

实验室里有荧光显微镜还要去用共聚焦显微镜呢？因为共聚焦显微镜成像效果比荧光显微镜好太多。

看这张荧光显微镜与共聚焦拍的细胞核和细胞骨架对比图，是不是感觉就像近视的你忘记戴眼镜和戴了眼镜看到的效果呢？随着大家越来越关注活体及活细胞实验的结果，加上传统活细胞工作站在分辨率上的限制，共聚焦无疑成为大家的首选方案。主要原因有：

1、分辨率高；

2、光毒性小很多，适合活细胞实验；

3、检测灵敏度非常高，成像速度也非常快。

共聚焦显微镜与荧光显微镜相比升级了激光光源、光电倍增管检测器并在检测器前加装了针孔，在硬件上实现了物镜观察到的样品焦点--针孔--检测器三点共轭避免了非焦平面杂散光的干扰，拍图时还能再做光学放大、平均降噪、平均叠加等设置让我们轻轻松松得到像图中那样的高清图片。

结论

激光扫描共聚焦显微镜是在传统荧光显微镜成像的基础上采用激光作为光源，通过使用激光扫描装置和共轭聚焦装置，利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理的现代化光学显微镜。

它能以极高的分辨率采集细胞或组织内部的荧光标记图像、观察细胞或组织内部的微细结构和形态学变化、在亚细胞水平观察胞内重要离子浓度或 pH 的变化、结合电生理技术观察和记录细胞的生理活动。使用激光扫描共聚焦显微镜，还可以对观察样品进行断层扫描和成像、重构和分析细胞的三维空间结构。

共聚焦显微镜原理

激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作扫描光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面逐点、逐行、逐面快速扫描成像。

扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点，通过控制调焦深度，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示所观察表面的立体结构。

激光共焦光学系统仅接收通过圆形针孔聚焦的光线，并非采集从样品上反射和散射的所有光线。这样有助于消除模糊，且由于点对点扫描去除了杂散光的影响，让其能够获得比普通显微镜对比度更高的图像。

在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度、"光学切片"(Optical sectioning)、三维重建、动态分析等优点，因而为表面分析及生物医学等研究提供了有效手段。

荧光造影剂的应用：外源性荧光造影剂可以增加共聚焦图像的对比度，例如绿色荧光蛋白在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，可以标识生物体内蛋白质的位置。在进行生物医学研究时，除了观测细胞微观结构的空间特性外，时间特性也是记录和分析细胞生命活动、蛋白质功能分析和药物疗效评估等的重要手段。对于具有荧光标识的样品而言，反映样品时间特性的参量是荧光寿命

功能·应用

突然袭来的新冠肺炎疫情，让人类又一次见识了病毒的威力。肉眼看不到的病毒作为一类物种，很可能从地球生命诞生之初就已经存在，而人类从意识到有病毒存在，再到看到病毒的模样，直至最后弄清病毒的内部结构成分，经历了漫长的过程。

“工欲善其事，必先利其器”。在国家加快培育战略性新兴产业、壮大经济发展新动能的当下，光学显微镜对于新材料、生物等新兴产业的发展具有影响创新能力的基础性地位。然而对于大部分光学显微镜用户而言，现有的光学超分辨技术缺乏全面反映样品生命活动的能力，在解决目前生命科学领域重大问题方面所做出的贡献依然甚微。作为研究或检测平台的超高分辨率显微系统的研制和发展，将极大促进生物、医学、材料等领域的原始创新，利于我国相关学科占领相应科学研究的制高点。

功能：

1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”

3.定量分析

4.图像处理

5.感兴趣区域扫描等

应用

1.定位、定量

2.动态测量

3.活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化

4.测量    (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+)

5.自由基的检测

6.药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量

应用实例（1）：

定位、定量

免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量：

如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器共定位、核转录因子转位和干细胞的增值、分化

染色体基因定位：

1) 细胞表面抗原、胞内某种蛋白

免疫荧光标记：与抗体耦联

直标: 一抗+荧光探针，一抗和细胞表面蛋白或者细胞内的蛋白结合

间标: 二抗+荧光探针，带有荧光的二抗和一抗结合

检测某种蛋白的表达变化（JAM3 maintains leukemia-initiating cell self-renewal through LRP5/AKT/β-catenin/CCND1 signaling）

2) 细胞膜表面受体

配体+荧光探针，如细胞表面有某种受体，则用其配体和荧光标记然后与其进行杂交，就可看到配体在细胞表面的分布

如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)

标记 Gm1: 霍乱毒素受体、霍乱毒素+FITC

应用实例（2）

共聚焦显微镜在类器官上的应用视频

在开发共聚焦系统时，无论是激光扫描，TIRF，激光片显微技术还是任何其他成像技术，激光源都是成像系统中最关键的元素。拥有稳定，可靠且易于使用的光源，您只需担心成像技术和数据收集上的麻烦。使用单独的Stradus®激光器或灵活的多线VersaLase™系统，您将获得已知的，高度可靠且极其稳定的照明输入，可满足您的成像需求，从而使您可以专注于研究，而无需经常维修或调整设置。那么今天小编要推出的品牌就是Vortran激光技术公司。

关于VLT——百年技术

Vortran激光技术公司（VLT）是一家光源系统公司，是一家激光产品开发和制造公司，总部位于加利福尼亚州罗斯维尔。VLT专业从事仪器级激光二极管模块和OEM光学子系统的设计和制造。Vortran激光技术-具有100多年经验的激光设计专家，为全球客户提供完整的光子学解决方案。

产品选型

1 STRADUS ®激光二极管模块Stradus ®激光器的线是一个依从CDRH-充分系列的高性能，环化的激光二极管模块

高度集成的Stradus ®模块包含所有必要的光功率调节，温度调节，通讯接口，和保护电路。

2 STRADUS®VERSALASE™多波长激光系统

Stradus ®  VersaLase ™ 系统是一个多波长激光系统被至多4个独立可控激光器内部结合。

3 STRADUS®LITE紧凑型OEM激光模块

Vortran激光技术的Stradus ® 用于需要对成本敏感的应用的高性能，但简化了设备的OEM应用精简版激光模块。这种高性能模块1/4我们的标准Stradus的大小®激光模块具有相同的性能和质量。